|
|
|
|
|
|
访问总数：18193 人次 |
 |
|
| |
|
|
 本刊论文 |
| 正交试验法优选川芎药效成分的超临界流体的几个方法分析 |
| 作者：胡立翠 时间：2016/09/27 点击：564 |
川芎为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎，具有活血行气、祛风止痛之功效，主治胸痹心痛、胸肋刺痛、跌打肿痛、月经不调、经闭痛经、癥瘕腹痛、头痛、风湿痹痛等[1]。目前，有关川芎的超临界流体提取方法研究主要是以阿魏酸[2-6]、川芎嗪[7]、藁本内酯[8]或挥发油[6，8]的产率为评价指标。然而，中药发挥药效通常是其所含多种活性成分共同作用的结果，仅以1或2种成分作为评价指标对工艺评价不尽合理。因此，本研究采用正交试验法，以川芎中已明确为药效成分的阿魏酸、洋川芎内酯-I、洋川芎内酯-H、瑟丹酸内酯、丁基苯酞、阿魏酸松柏酯、藁本内酯、丁烯基苯酞、双藁本内酯、欧当归内酯A等10种成分以及总药效成分的产率作为考察指标，对影响超临界流体萃取效果的萃取温度、萃取压力、二氧化碳流速和夹带剂浓度进行优选，以确定最佳提取工艺条件，为川芎的进一步研究和开发提供依据。
1 材料
Dionex Ultimate 3000型高效液相色谱仪（光电二极管阵列检测器、Chromeleon色谱工作站）；XS105型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Spe-ed SFE型超临界萃取仪（美国Applied-Separations公司）；HGC-12氮吹仪（天津恒奥科技发展有限公司）。
阿魏酸、洋川芎内酯-I、洋川芎内酯-H、瑟丹酸内酯、丁基苯酞、阿魏酸松柏酯、藁本内酯、丁烯基苯酞、双藁本内酯、欧当归内酯A对照品为本实验室自制（HPLC归一化分析，纯度均大于98%，结构鉴定数据与文献报道一致）；甲醇为色谱纯；水为超纯水；无水乙醇、冰醋酸为分析纯；二氧化碳（纯度大于99%）由天津市四知气体有限公司提供。
川芎药材购于天津中新药业药材公司并被鉴定为伞形科多年生草本植物川芎L.chuanxiong的干燥根茎，产地为四川灌县，样本存于天津大学药物科学与技术学院天然药物化学实验室。
2 方法与结果
2.1 HPLC测定方法的建立
2.1.1 色谱条件[9-10] Capcell Pak C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相甲醇（A）-0.5%冰醋酸溶液（B），梯度洗脱，0～32 min，30%～85% A，32～39 min，85%～100% A；检测波长280 nm；流速0.7 mL·min1；柱温30 ℃；进样量10 μL。混合对照品和超临界流体萃取产物的HPLC图见图1。
2.1.2 混合对照品溶液的制备，标准曲线绘制及精密度考察 相关试验参见文献[9]。
2.1.3 供试品溶液的制备 精密称定超临界流体萃取产物24 mg于10 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容至10 mL，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
2.1.4 稳定性考察 取同一份供试品溶液，分别在制备后0，2，4，8，12，24 h，按2.1.1项下色谱条件测定，记录峰面积。结果表明阿魏酸、洋川芎内酯-I、洋川芎内酯-H、瑟丹酸内酯、正丁基苯酞、阿魏酸松柏酯、藁本内酯、正丁烯基苯酞、双藁本内酯和欧当归内酯A峰面积的RSD分别为1.9%，1.0%，0.95%，1.1%，1.9%，1.1%，1.1%，1.7%，1.5%，1.3%，说明10种药效成分均在24 h内稳定。
2.1.5 重复性试验 取川芎样品5份，精密称定，按2.1.3项下平行制备5份供试品溶液，以2.1.1项下色谱条件进行测定，记录峰面积，标准曲线法计算含量和RSD。阿魏酸、洋川芎内酯-I、洋川芎内酯-H、瑟丹酸内酯、正丁基苯酞、阿魏酸松柏酯、藁本内酯、正丁烯基苯酞、双藁本内酯和欧当归内酯A含量的RSD分别为0.95%，1.9%，1.6%，1.9%，1.5%，1.9%，1.9%，1.1%，1.2%，1.3%，表明方法重复性良好。
2.1.6 加样回收率试验 精密称定川芎超临界流体萃取产物6份，每份24 mg，分别精密加入混合对照品溶液，按照2.1.1项下条件进行测定，计算回收率。结果阿魏酸、洋川芎内酯-I、洋川芎内酯-H、瑟丹酸内酯、正丁基苯酞、阿魏酸松柏酯、藁本内酯、正丁烯基苯酞、双藁本内酯和欧当归内酯A的平均回收率及其RSD分别为98.30%（1.9%），99.00%（1.7%），98.00%（2.0%），97.60%（1.5%），94.50%（2.0%），99.30%（1.9%），100.9%（1.8%），101.2%（1.9%），95.10%（2.0%），101.5%（1.8%），表明方法回收率良好。
2.2 超临界CO2萃取试验
2.2.1 超临界CO2萃取川芎药效成分的流程 将川芎药材粉碎，精密称定10 g装入萃取柱中，调节至设定的参数（萃取温度、萃取压力、CO2流速和夹带剂流速）进行超临界萃取，当达到试验设定的萃取时间2 h后停止萃取。氮气吹干超临界流体萃取产物，备用。
2.2.2 正交试验设计 采用正交试验的方法来确定最佳萃取条件。选择影响提取效果的4个主要因素，即萃取温度（A）、萃取压力（B）、二氧化碳流速（C）、夹带剂质量分数（D）进行4因素3水平正交试验，因素与水平见表1。
2.2.3 正交试验结果及分析 以10种药效成分及总药效成分的产率为指标，选用L9（34）正交设计表进行试验，结果见表2，方差分析见表3。结果表明，因素A对洋川芎内酯-H、洋川芎内酯-I、丁烯基苯酞、欧当归内酯A的提取有显著性影响，对其他成分无显著性影响，故选择这4种成分提取的最佳温度，即萃取温度为60 ℃；因素C对欧当归内酯A的提取有显著性影响，对其他成分的提取无显著性影响，故二氧化碳流速选取欧当归内酯A的最佳条件，即二氧化碳流速为1 L·min1；因素B，D对所有指标均无显著性影响，但是各成分的最佳萃取压力和夹带剂浓度一致，萃取压力均为25 MPa，夹带剂质量分数均为8%。综合以上分析结果，最佳萃取方法为A3B2C2D3，即萃取温度60 ℃，萃取压力25 MPa，二氧化碳流速1 L·min1，夹带剂（无水乙醇）质量分数为8%。
2.2.4 验证试验 为进一步考察优选工艺的重复稳定性，在优化条件下，即萃取温度60 ℃，萃取压力25 MPa，二氧化碳流速1 L·min1，夹带剂（乙醇）质量分数为8%进行3次重复试验。结果阿魏酸、洋川芎内酯-I、洋川芎内酯-H、瑟丹酸内酯、正丁基苯酞、阿魏酸松柏酯、藁本内酯、正丁烯基苯酞、双藁本内酯、欧当归内酯A和总药效成分的RSD分别为1.8%，0.9%，1.0%，1.2%，2.4%，1.3%，1.3%，1.8%，0.60%，1.3%，表明本工艺稳定、重复性好。
2.3 超临界CO2流体萃取法与回流提取法比较
《中国药典》（2010年版）中采用回流提取法提取川芎中药效成分[1]。故精密称定川芎样品2 g，按药典方法进行提取，重复试验3次，与超临界流体萃取法比较，结果见表4。采用SPSS 17.0统计软件对所得数据进行t检验，结果表明2种方法对丁基苯酞和双藁本内酯的产率无显著性影响；采用回流提取法阿魏酸、洋川芎内酯-I、洋川芎内酯-H、丁烯基苯酞、欧当归内酯A的产率显著高于超临界流体萃取法（P<0.05）；而超临界流体萃取得到的瑟丹酸内酯、阿魏酸松柏酯、藁本内酯和总药效成分的产率明显高于回流提取法。
3 讨论
3.1 夹带剂的选择
前期试验比较了乙酸乙酯与无水乙醇作为提取溶剂时对川芎药效成分的提取效果，结果表明无水乙醇对药效成分的产率较高[9]。因此，本试验采用无水乙醇作为超临界流体萃取的夹带剂提高了总药效成分的产率。
3.2 结果分析
由于研究中得到的川芎嗪含量低于检测限，故以阿魏酸、洋川芎内酯-I、洋川芎内酯-H、瑟丹酸内酯、正丁基苯酞、阿魏酸松柏酯、藁本内酯、正丁烯基苯酞、双藁本内酯和欧当归内酯A等药效成分及总药效成分的产率为研究指标对结果进行评价。
正交试验结果表明，不同的药效成分即使在相同因素条件下变化规律也不完全一致；同时，由于药材产地、采收时间的差异，各药材中药效成分的含量也有一定的差异。所以，单以总药效成分为评价指标得到的最佳工艺不一定适用于其他批次或来源的药材。本研究以各单一药效成分为指标，分别考察不同因素对各成分产率的影响，能够得出因素对各指标成分的影响规律，进而得到各指标成分的最佳工艺。对于其他批次或来源的药材，可以根据药材中各成分的含量确定该批次药材的最佳提取工艺；如果提取目标只是其中的某种或某几种成分可以根据相应的规律确定最优提取工艺。
本研究得到川芎药效成分的最佳提取工艺为萃取温度60 ℃，萃取压力25 MPa，二氧化碳流速1 L·min1，夹带剂（乙醇）质量分数为8%。现有文献报道阿魏酸的超临界流体萃取方法分为无夹带剂[2]和加入乙醇作为夹带剂[3-4]2类，而后者又可分为一步法和分步法[3]2种方法。由于阿魏酸的极性较大，不加夹带剂时CO2超临界流体对其的溶解性和渗透能力均低于加入适量乙醇夹带剂的超临界流体。无夹带剂时的最佳条件采用较高的温度（70 ℃）可能与阿魏酸松柏酯在较高温度下易分解成阿魏酸有关。本研究中，当温度提高时阿魏酸产率提高而阿魏酸松柏酯产率则下降可以作为佐证。一步法加入较分步法加入对阿魏酸的提取更有利[3]，文献中采用正交试验法对一步法加入乙醇作为夹带剂的工艺进行了系统的优化，得到阿魏酸的最佳提取工艺为萃取压力45 MPa，萃取温度为55 ℃，萃取时间为3.5 h[4]。本研究中萃取温度略高于该方法，但是萃取压力远低于该方法，降低了设备能耗，同时由于采用动态法加入夹带剂，使得成分在超临界流体中的溶解度更大，萃取时间更短。本研究得到藁本内酯的最佳提取工艺为萃取温度50 ℃，萃取压力25 MPa，二氧化碳流速2 L·min1，夹带剂（无水乙醇）质量分数为8%，与文献报道的藁本内酯的最佳萃取温度（50 ℃）和萃取压力（30 MPa）接近[8]。
本研究在最佳提取条件下与2010年版《中国药典》中川芎含量测定项下的提取方法进行比较，结果表明2种方法对丁基苯酞和双藁本内酯的产率无显著性影响；采用回流提取法，阿魏酸、洋川芎内酯-I、洋川芎内酯-H、丁烯基苯酞、欧当归内酯A的产率显著高于超临界流体萃取法（P<0.05）；而超临界流体萃取得到的瑟丹酸内酯、阿魏酸松柏酯、藁本内酯和总内酯的产率明显高于回流提取法（P<0.05）。造成这种结果的原因可能是长时间的高温使阿魏酸松柏酯分解成阿魏酸[11]，从而使得回流提取法得到的阿魏酸松柏酯产率低于超临界流体萃取，而阿魏酸含量则高于超临界流体萃取。另外，超临界流体萃取在低温避光下有效防止了热敏性物质藁本内酯和瑟丹酸内酯的降解，使得这2种成分的超临界流体萃取法产率高于回流提取法，而洋川芎内酯-I和洋川芎内酯-H产率较超临界流体萃取法高很可能是藁本内酯在高温下降解产生的影响[12]。这些结果在以单一成分或挥发油等总指标下进行提取条件优化所看不到的，这也充分说明了多指标条件优化的优势和必要性。 |
|
|
|
|
